Isoelektrische Fokussierung auf immobilisierten pH-Gradienten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von „langen", d.h. > 30 cm Länge, immobilisierten pH-Gradienten, insbesondere zur isoelektrischen Fokussierung, sowie eine Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung bestehend aus einer lEF-Kammer (isoelektrische Fokus- sierungskammer) und einem Stromversorger.
Die Verwendung von elektrophoretischen Methoden für präparative Zwecke ist eine etablierte Technik, und es existieren verschiedene Apparate für präparative und analytische Zwecke. Diese Apparate und ihre zugrunde liegenden Prinzipien können in drei Kategorien aufgeteilt werden (Andrews, 1986, Westermeier, 1977).
a) Zonenelektrophorese b) Isotachophorese c) Isoelektrische Fokussierung
Zonenelektrophorese beinhaltet die Glycin, Bicin und Tricin gepufferten Natriumdodecylsulfat -Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) für Proteine, die routinemäßig für die Untersuchung von Proteinen eingesetzt wird (Wilkins et al. 1998).
Die Isotachophorese benutzt hydrophile Matrixmaterialien und zeigt typischerweise eine hohe Auflösung, aber eine geringe Beladungskapazität.
In Kombination mit Free-Flow-Elektrophorese kann diese Methode für mikropräparative Zwecke eingesetzt werden (Weber und Bocek, 1998).
Die isoelektrische Fokussierung (IEF) wird entweder in flüssigen Dichtegradienten, in Gelgradienten (Righetti, 1990) oder in Mehrkammer-Geräten mit Immobiline-basierenden Trenngelmedien (Righetti et al., 1997) durchgeführt.
Es gibt zwei etablierte lEF-Methoden im Rahmen der Durchführung einer zweidimensionalen Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE). Die als erstes entwickelte Methode verwendet eine Vorfokussierung von Trägerampholyten (TA) an ihren isoelektrischen Punkt und eine anschließende Fokussierung von Proteinen. Die so aufgetrennten Proteine werden dann in einer zweiten Dimension in einer SDS-PAGE aufgetrennt (Klose, 1975; Klose und Kobalz, 1995; O'Farrel, 1975). Dieses System besitzt eine hervorragende Auflösung und erreicht bei der Verwendung von 46 cm TA-IEF-Gelen eine Auftrennung von über 10.000 Proteinspots pro 2D-PAGE Gel (Klose und Kobalz, 1995). Kürzlich wurden auch kommerzielle Systeme mit bis zu 60 cm TA-IEF-Gelen angeboten (www.proteomefactory.com/ct_02112.html; Stand: 28.08.2002). Dennoch besteht bei diesem System das Problem, dass die basische Region des pH-Gradienten aus dem Gel heraus wandert, bevor ein Gleichgewicht erreicht ist. Diese kathodische Instabilität wird durch Bi- carbonat-lonen verursacht, welche mit atmosphärischem Kohlendioxid im Gleichgewicht stehen (Righetti, 1990). Um Proteine im basischen pH- Bereich zu untersuchen, wird ein lEF-Experiment vor dem Erreichen des Gleichgewichts abgestoppt. Zu diesem Zeitpunkt ist die Auftrennung der Proteine noch nicht komplett, aber die basische Region befindet sich noch im Gel. Diese Form der IEF (non-equilibrium pH gradient gel e- lectrophoresis, NEPHGE) ist die einzige Möglichkeit, basische Proteine in einem trägerampholyt-basierenden Gelsystem zu analysieren.
Ein später entwickeltes System zur isoelektrischen Fokussierung verwendet acrylamid-ähnliche Acrylamido-Puffer Monomere (Immobiline), die eine funktionelle Puffergruppe tragen. Ein pH-Gradient wird durch die Bildung eines Konzentrationsgradienten von Gellösungen mit verschiedenen pH-Werten geformt. Nach der Bildung des Gradienten poly- merisieren die Acrylamido-Puffer-Monomere zusammen mit der Arcyla- mid-Matrix und werden somit immobilisiert (Görg et al., 2000; Görg et al. 1988; Righetti, 1990). Diese immobilisierten pH-Gradienten (IPG) - Gele werden gegossen, in dem man einen Dichtegradienten mit Glycerol zwischen den zwei Lösungen unterschiedlicher pH-Werte aufbaut. Da dieser Vorgang diffusionslimitiert ist, sind die hergestellten Immobilingra- dienten typischerweise weniger als 30 cm lang, um einen korrekten Dichtegradienten zu gewährleisten. Daher wurde bisher nicht über immobilisierte pH-Gradienten mit mehr als 30 cm Länge berichtet. Die längsten kommerziell erhältlichen IPGs sind 24 cm lang und werden von Amersham Biosciences angeboten.
Alle bisher entwickelten und erhältlichen Systeme zur isoelektrischen Fokussierung haben daher generell das Problem, dass sie kaum bzw. unvollständig basische Proteine auftrennen bzw. aufgrund der Limitation auf vergleichsweise kurze immobilisierte pH-Gradienten eine nicht ausreichende Auflösung aufweisen.
Erwünscht wäre daher ein System, in dem sämtliche Analyten, wie z.B. körpereigene Proteine, bei größtmöglicher Auflösung aufgetrennt und analysiert werden können.
Ziel der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten sowie eine Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung bereitzustellen, welches die im Stand der Technik vorhandenen Nachteile zumindest teilweise löst.
Dieses Ziel wird erreicht durch die Vorrichtung und die Verfahren, wie sie in den Ansprüchen 1 , 9 und 17 definiert sind. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 8, 10 bis 16 und 18 bis 28 dargelegt. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass man besonders gute isoelektrische Fokussierungen durchführen kann, d.h. isoelektrische Fokussierungen mit extrem guter Auflösung und Auftrennung, wenn hierfür hohe Spannungen, also Spannungen > 10 kV, angelegt werden.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung (IEF) mit einer sogenannten lEF-Kammer (Kammer, in der die isoelektrische Fokussierung durchgeführt wird) und einer Stromversorgung zur Bereitstellung einer Fokussierungsspannung für mindestens einen immobilisierten pH-Gradienten, wobei die Vorrichtung eine Stromversorgung aufweist, die eine maximale Fokussierungsspannung von mindestens 10 kV, vorzugsweise mindestens 20 kV, insbesondere mindestens 35 kV, liefert. Dies ermöglicht die Verwendung langer pH- Gradienten, insbesondere mit Längen von mehr als 30 cm, wodurch sich die erzielbare Auflösung stark verbessert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Stromversorgung vollständig in der lEF-Kammer angeordnet. Dabei kann es sich um eine Stromversorgung handeln, der die weiter oben beschriebenen Spannungen liefert. Jedoch sind von der vorliegenden Erfindung auch jene Stromversorger umfasst, die weniger als 10 kV oder mehr als 35 kV liefern.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Vorrichtung mindestens einen pH-Gradienten mit einer Mindestlänge von 30 cm auf. Weiterhin kann vorzugsweise dieser pH-Gradient eine Länge von min-
destens 40 cm, vorzugsweise mindestens 50 cm, insbesondere mindestens 90 cm, aufweisen. Es sei in diesem Zusammenhang daran erinnert, dass die Bereitstellung einer lEF-Kammer für IPGs > 30 cm schon für sich alleine eine erfinderische Leistung darstellt, da diese zuvor weder vorhanden noch beschrieben war. Somit kann die lEF-Kammer alleine oder in Kombination mit dem Stromversorger, einem oder mehrerer Kabel, mindestens einen immobilisierten pH-Gradienten und/oder weiterer Komponenten zur isoelektrischen Fokussierung betrieben werden. Die lEF-Kammer für immobilisierte pH-Gradienten > 30 cm alleine sowie alle denkbaren Kombinationen dieser Kammer mit einer oder mehreren weiteren Komponente(n) für die isoelektrische Fokussierung (z.B. Stromversorger, Kabel, immobilisierte pH-Gradienten, Verriegelungsmittel etc.) werden hiermit offenbart und zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemacht.
Die Stromkabel zwischen der Stromversorgung und der lEF-Kammer können vorzugsweise während der IEF fest installiert, also nicht entfernbar, sein. Die IPGs können weiterhin von einem elektrisch isolierenden Material umgeben sein, das fest oder flüssig sein kann.
Weiterhin kann die Stromversorgung mit der lEF-Kammer über mindestens ein hochspannungsfestes Kabel gekoppelt sein, das eine der maximalen Fokussierungsspannung angepasste Spannungsfestigkeit aufweist. Die Stromkabel können dabei zwischen der Stromversorgung und der lEF-Kammer fest installiert sein. In einer Variante ist der Stromversorger vollständig in der lEF-Apparatur integriert und mit einem Mechanismus versehen, der den Stromversorger abschaltet, sobald die Kammer geöffnet wird und somit sicherstellt, dass kein Benutzer der Apparatur durch den an die Apparatur angelegten Strom gefährdet wird. Vorzugsweise kann die Apparatur ein Verriegelungsmittel aufweisen, das ein Öffnen der lEF-Kammer nach Abschalten der Stromversorgung für eine begrenzte Zeit, in der Regel mindestens 2 min., verhindert, bis sich
eine verbleibende Hochspannung auf einen ungefährlichen Wert abgebaut hat.
Wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung unter Hochspannung betrieben werden soll ist es vorteilhaft, wenn Kabel verwendet werden, die für die anzulegende Hochspannung ( insbesondere 10.000 bis 30.000 Volt) geeignet, insbesondere spannungsisolierend sind, so dass bei der Bedienung keine gefährlichen Spannungsüberschläge auftreten. Dabei kann der stromleitende Teil der Kabel vollständig von der Umgebungsluft isoliert sein.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten, insbesondere zur isoelektrischen Fokussierung, wobei die pH-Gradienten mindestens eine Länge von 30 cm aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die pH- Gradienten mindestens eine Länge von 40 cm, vorzugsweise mindestens 50 cm, insbesondere mindestens 90 cm, auf. Erneut sei daran erinnert, dass bisher nicht über immobilisierte pH-Gradienten mit mehr als 30 cm Länge berichtet wurde. Die längsten kommerziell erhältlichen IPGs sind 24 cm lang. Somit umfasst die vorliegende Erfindung nicht „nur" das Verfahren zur Herstellung immobilisierter pH-Gradienten mit Mindestlängen > 30 cm, vielmehr sind auch die immobilisierten pH- Gradienten selbst durch die vorliegende Erfindung offenbart und werden hiermit zu deren Gegenstand gemacht.
Mit 'der vorliegenden Erfindung können lange bis extrem lange IPGs hergestellt werden. Dabei ist eine charakteristische Eigenschaft dieser IPGs, dass diese immobilisierten pH-Gradienten über 30 cm lang sind, vorzugsweise bis ca. 100 cm oder mehr. Die Herstellung solch langer Gradienten ist schwierig. So ist, um einen gleichmäßig langen Gradienten zu erstellen, eine langsame, pulsationsfreie Flussrate der einzelnen, mindestens zwei, Pufferkomponenten beim Gießvorgang zu gewährleis-
ten. Dieser Vorgang kann mit Hilfe von z. B. computergesteuerten "Kol- benbüretten" oder ähnlichen Pumpen ermöglicht werden. Um die langsamen Flussraten zu gewährleisten, ist eine Kontrolle der Polymerisationsgeschwindigkeit unerlässlich. Diese wird z.B. gewährleistet durch die kontinuierliche computergesteuerte Zugabe von Polymerisationsinitiatoren (wie z. B. Ammoniumperoxosulfat) während des Gießvorgangs oder durch eine Kühlung der Pufferlösungen und des gegossenen Gradienten und eine anschließende kontrollierte Temperaturerhöhung zum Starten der Polymerisation oder durch die Verwendung von nach der Mischung des Gradienten aktivierbaren Polymerisationsinitiatoren (z. B. UV-Licht induzierbar wie z. B. Riboflavin oder Methylenblau, Rabilloud et al., 1996b und darin enthaltene Referenzen) oder durch eine Kombination der vorher genannten Methoden. Für die Generation eines Dichtegradienten zur Herstellung von langen Gelen eignen sich bevorzugt schwere Pufferlösungen mit einer Dichte größer als 1 ,1. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt die Dichtedifferenz zum Aufbau eines Dichtegradienten mindestens 0,1 g/cm3, vorzugsweise 0,2 g/cm3, insbesondere größer als 0,2 g/cm3. Zur Generation dieser Dichten werden vorzugsweise mindestens zwei Pufferlösungen verwendet. Besonders geeignet sind beispielsweise folgende Komponenten oder Gemische der Komponenten: Glycerin, Cäsiumchlorid, Cäsiumsulfat, Cäsi- umbromid, Natriumbromid, Kaliumbromid, Saccharose.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zur Herstellung der pH- Gradienten mit den gewünschten Mindestlängen während des Gießvorgangs über noch auszupolymerisierende Gele kontinuierlich Polymerisationsinitiatoren zugegeben. Dies erfolgt vorzugsweise durch die Zugabe der Polymerisationsinitiatoren mittels computergesteuerter Applikatoren, insbesondere Büretten oder ähnliche Pumpen.
Vorzugsweise werden während des Gießvorgangs über noch auszupolymerisierende Gele zu applizierende Lösungen (unter Lösungen sind
insbesondere Acrylamidopuffer enthaltende Lösungen zu verstehen) und die Gele selbst gekühlt, so dass die pH-Gradienten die gewünschte Mindestlänge erlangen. Nach der Kühlung der Lösungen und der Gele kann erfindungsgemäß weiterhin die Temperatur zum Starten der Polymerisationsreaktion kontrolliert erhöht werden und/oder nach Mischung des Gradienten aktivierbare Polymerisationsinitiatoren verwendet werden, so dass durch diese Maßnahmen die pH-Gradienten die erwünschte Mindestlänge aufweisen.
Die vorliegende Erfindung kann weiterhin dazu benutzt werden, isoelektrischen Fokussierungen (IEF) von Analyten, wie z. B. Proteinen, in mindestens einem immobilisierten pH-Gradienten vorzunehmen, der durch eines oder mehrerer der weiter oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Es handelt sich damit um einen extrem langen immobilisierten pH-Gradienten, wobei die Copolymerisation eines vorgeformten pH-Gradienten in eine Matrix wie z. B. Polyacrylamid oder einer Polymermatrix mit ähnlicher Polymerisationschemie von Monomeren, ähnlich zu Acrylamid und Bisacrylamid, erfolgt. In einer bevorzugten Variante der Erfindung wird die IEF unter hohen Voltzahlen, mindestens 10.000 V, vorzugsweise mindestens 20.000 V, insbesondere mindestens 30.000 V, durchgeführt. Derart hohe Voltzahlen wurden bisher von Experten vermieden, weil man befürchtete, dass die Entstehung von Entladungsfunken und die Hitzeentwicklung den isoelektrischen Fokus- siervorgang stören könnte und wegen der potentiellen Gefahr für Mitarbeiter. Hieraus folgte aber, dass die Fokussierzeit für z. B. 54 cm IPG- Stre*ifen pH 4-8 bei 10.000 V 75 Stunden dauert; in Gegensatz zu weniger als 37 Stunden bei einer Voltzahl von 20.000 V, und 25 Stunden bei einer Voltzahl von 30.000 V. Daher stellt die Anwendung von hohen Voltzahlen während der IEF von langen IPGs eine erfinderische Leistung dar, die den Durchsatz stark erhöht und darüber hinaus die Spotgröße der an ihrem isoelektrischen Punkt (pl) fokussierten Proteine verkleinert. Die hohen Voltzahlen werden durch die Verwendung eines e-
lektrisch isolierenden Mediums, insbesondere eines Öls, ermöglicht, das die Elektroden und die IPG-Streifen während der IEF umgibt.
Eine geeignete Substanz ist das Dimethylpolysiloxanöl AK10 der Firma Wacker-Chemie GmbH, 84489 Burghausen, Deutschland, das Isolationseigenschaften von besser als 1014 Ohm cm aufweist.
Es hat sich in der Praxis als vorteilhaft herausgestellt, wenn die immobilisierten pH-Gradienten unter einer Ölschicht oder einer ähnlichen organischen/elektrisch isolierenden Schicht fokussiert werden, da die immobilisierten pH-Gradientengele ansonsten über die Zeit langsam durch Wasserverlust an die Atmosphäre austrocknen würden.
Die Auflösungskapazität von dem derzeitigen Stand der Technik entsprechenden IPG-Streifen und die resultierenden 2D-PAGE Gele limitieren die Anzahl der Proteine, die detektiert werden können. Aufgrund dieser geringen Auflösung können mit wenig sensitiven Detektions- methoden (z. B. Silberfärbung oder Fluoreszenzfärbung) oder mit hochsensitiven Detektionsmethoden (z .B. Radio-Imaging) nur eine ähnliche Anzahl an Proteinen detektiert werden. Wenn jedoch die Auflösungskapazität der 2D-PAGE Gele erhöht wird, erzielt man bei der Verwendung von hochsensitiven Radio-Imaging basierenden, fluoreszenz-basieren- den oder massenspektroskopie-basierenden Detektionsverfahren im Vergleich zu anderen Methoden eine signifikante Steigerung der Detek- tionsrate. In diesem Zusammenhang ist es vorteilhaft, wenn mindestens zwe'i verschiedene Proben mit unterschiedlichen Radioisotopen und/ oder verschiedenen Gemischen von Radioisotopen und/oder mindestens zwei Proben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen und/ o- der verschiedener Gemische von Fluoreszenzfarbstoffen und/oder mindestens zwei verschiedene Proben mit unterschiedlichen stabilen Isotopen und/oder verschiedenen Gemischen von stabilen Isotopen und/ o-
der mindestens zwei verschiedene Proben mit unterschiedlichen mas- sendifferenten Reagenzien markiert werden.
In diesen bevorzugten Darstellungen der Erfindung sind die zu untersuchenden Analyten (z. B. Proteine), insbesondere mit Radioisotopen, stabilen Isotopen, Fluoreszenzfarbstoffen oder massendifferenten Reagenzien, markiert, durch 2D-PAGE aufgetrennt und mit einem geeigneten Detektor detektiert. In dieser besonders bevorzugten Variante der Erfindung werden zwei oder mehr Proben mit unterschiedlichen Radio-Isotopen oder verschiedenen Gemischen von Radio-Isotopen, oder verschiedenen stabilen Isotopen oder Fluoreszenzfarbstoffen oder massendifferenten Reagenzien markiert und in einem 2D-PAGE Gel zusammen aufgetrennt und anschließend separat mit geeigneten Detektoren detektiert. Dieses ermöglicht die Erstellung von Gelbildern, der einzelnen ursprünglichen markierten Proben. Für diese besondere Art der Analyse wird ein Detektor benötigt, der auf der Basis von physikalischen Eigenschaften und Halbwertszeiten der verwendeten Markierungsreagenzien zwischen den unterschiedlich markierten Proben unterscheiden kann.
Die immobilisierten pH-Gradienten können erfindungsgemäß nach dem Gießen in sogenannte IPG-Streifen (immobilisierte pH-Gradienten- Streifen) beliebiger Breite geschnitten werden. Diese können dann bis zur Verwendung gelagert, vorzugsweise bei -20°C, oder direkt für die isoelektrische Fokussierung verwendet werden. Die zu analysierende Probe, insbesondere Proteine, werden dann vorzugsweise mittels aktiver' Rehydratation in die IPG-Streifen eingebracht, d.h. beladen. In diesem Prozess werden die Proteine aktiv, während der Rehydratation der trockenen IPG-Streifen in einer Rehydratationskammer, bei geringer Voltzahl, typischerweise weniger als 1250 V, eingebracht. Der IPG- Streifen wird dann häufig in eine zweite Kammer transferiert, die weite Elektroden enthält. Der Kontakt zu den Elektroden wird über leitende Elemente (Medien) (z. B. Wasser enthaltende und/oder mit wässrigen,
Chemikalien enthaltende Lösungen getränkte Filterpapierstreifen) an beiden Enden der IPG-Streifen hergestellt. Die Filterpapierstreifen werden in zeitlichen Intervallen während der IEF mindestens einmal ausgetauscht, um im Filterpapier akkumulierende Ionen zu entfernen. Die Entfernung dieser im Filterpapier akkumulierenden Ionen ist für hochwertige Resultate besonders vorteilhaft.
Schließlich ist von Vorteil, wenn die Temperatur während der isoelektrischen Fokussierung nahezu konstant gehalten wird, um die Reproduzierbarkeit der IEF zu verbessern. Maximale Temperaturschwankungen von +/- 5 °C, insbesondere von +/- 2 °C, sind hierbei bevorzugt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die isoelektrische Fokussierung in langen bis extrem langen immobilisierten pH-Gradienten (> 30 cm Länge) insbesondere durch eine Kombination der nachfolgend beschriebenen verschiedenen Faktoren ermöglicht wurde:
a. Die Verwendung computergesteuerter Applikatoren, insbesondere Büretten, zur reproduzierbaren Herstellung der pH-Gradienten. b. Die Verwendung einer elektrisch isolierenden Schicht, insbesondere einer Ölschicht, während der Fokussierung, so dass die Austrocknung der Gele an der Atmosphäre verhindert werden kann. c. Die Verwendung von sehr hohen Spannungen während der Fo- kussierungsprozedur.
Diese Methoden stellen eine wertvolle Erweiterung der bisher bestehenden Möglichkeiten zur Untersuchung komplexer Zusammenhänge, wie sie z.B. in der Proteomforschung vorliegen, dar, so dass Wissenschafter bzw. Forschungsunternehmen sowie alle auf diesem oder anderer Gebiete tätigen mit Hilfe der vorliegenden Erfindung in die Lage versetzt werden, Zusammenhänge aufzuklären und neue Erkenntnisse zu gewinnen.
Die bestehenden Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen und der Figur. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Abbildungen zeigen:
Fig. 1 : 2D-Gel von 150 g Proteinextrakt aus menschlichem Prostatakrebsgewebe fokussiert auf einem 54 cm langen IPG- Streifen pH 4-8.
Das nachfolgende Beispiel dient zur näheren Erläuterung der Erfindung.
Material und Methoden:
Menschliches Prostatakrebsgewebe wurde extrahiert und für die IEF vorbereitet nach Vuong et al. (2000) mit der Modifikation, dass die Proteine nicht jodiert wurden.
Herstellung von 54 cm langen IPG-Gelen
Die Gele wurden in einer Gießkammer (12 cm x 54 cm x 0,5 mm) bestehend aus zwei Glasplatten und einem U-förmigen Abstandhalter und einer Trägerfolie (Gel-Fix Folie, Serva, Heidelberg) gegossen. Die Glasplatten und Spacer werden hierzu sorgfältig gereinigt. Die Glasplatte mit Spacer wird anschließend mehrfach mit Repel-Silane (Amersham Bio- sciences, Freiburg) behandelt. Die Gel-Fixfolie wird auf die gereinigte und mit Wasser bedeckte Deckglasplatte gelegt, mit Papier bedeckt und mit einer Gummiwalze das Wasser luftblasenfrei entfernt. Anschließend
wird die Platte mit dem Abstandhalter aufgesetzt und die Kammer mit Klemmen versehen. Die Gelkammer wird dann auf 4 °C gekühlt. Zur Vorbereitung der Gellösungen werden gemäß Kammervolumen die saure und basische Lösung bestehend aus Acrylamido-puffern, Acrylamid, PDA (Piperazin-diacrylamid), KBr und TEMED (N,N,N',N'-Tetramethyl- ethylendiamin) vorbereitet. APS (Ammoniumpersulfat) wird später während der Gradientenherstellung kontrolliert zugesetzt. Das Gießen der Gele und die computergestützte Berechnung der Mischungsverhältnisse der Acrylamidopuffer (Immobiline) zur Herstellung des pH-Gradienten erfolgt nach der Methode von Altland und Altland (1984). Für die Herstellung eines linearen pH 4-8 Gradienten wurden folgende Immobilin- Verhältnisse in einem Endvolumen von 10 ml verwendet.
Saure Lösung Basische Lösung
Immobiline pK 3,6 392,5 l 0,0 l
Immobiline pK 4,6 169 l 369,2 μ\
Immobiline pK 6,2 156,8 l 239,6 μ\
Immobiline pK 7,0 78,2 /l 94,7 μl
Immobiline pK 8,5 113,04 l 222,7 μl
Der Gradient wird mit computergesteuerten Büretten (Desaga) gegossen, wobei Bürette 1 die saure Lösung, Bürette 2 die basische Lösung und Bürette 3 die 2,5 % (w/v) (Gewicht/Volumen) Ammoniumpersulfatlösung enthält. Die Gele werden nach dem Gießen für 10 min stehen gelassen und dann 1 h bei 50 °C auspolymerisiert. Anschließend wird das Gel' mit der Trägerfolie 4 mal 15 Minuten in 1 ,5 % Glycerol gewaschen und getrocknet. Die Geloberfläche wird mit einer Folie abgedeckt und das basische und saure Ende markiert. Anschließend wird das Gel in 4 mm breite Streifen geschnitten und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.
Isoelektrische Fokussierung
150 μg Protein in 1200 μl Rehydratisierungspuffer (8M Harnstoff, 2 % Chaps, 0,5 % (v/v) IPG Puffer, 20 mM DTT (Dithiothreitol), etwas Bromphenolblau) werden zur Rehydratation der IPG-Streifen verwendet. Die Rehydratation erfolgte über 15 h bei 100 V in einer speziellen Rehydratationskammer unter DryStrip Cover Fluid (Amersham Biosciences, Freiburg). Anschließend wurden die Streifen in eine zweite Kammer überführt. Hier wurde der Kontakt zwischen den Enden der IPG-Streifen und der Elektroden mittels 8M Harnstoff, 2 % Chaps (3-((3-Cholamidopro- pyl)dimethylammonium)-1 -propansulfonat) getränkten Filterpapierstreifen (8M Harnstoff, 2 % Chaps) hergestellt.
Zur Fokussierung der Proben wurde folgendes Programm verwendet:
500 V 1 Stunde
1250 V 1 Stunde
2500V 30 Minuten
20.000V bis 125.000 Voltstunden
Diese Filterpapierstreifen wurden dann nach den ersten drei Fokussie- rungsschritten gewechselt. Die Ströme wurden limitiert auf 60 Mikroampere je IPG-Streifen. Bei anderen Versuchen wurden Spannungen bis zu 35.000 Volt unter ähnlichen Bedingungen angewendet.
Nach der Fokussierung wurden die 54 cm Streifen in 3 x 18 cm Streifen zerschnitten und in der zweiten Dimension (2D-SDS-PAGE) aufgetrennt, wie bei Vuong et al. (2000) beschrieben. Die Färbung der Gele mittels Silber er olgte nach Heukeshoven und Dernick (1988).
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