WO2004023131A1 - Isoelektrische fokussierung auf immobilisierten ph-gradienten - Google Patents

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WO2004023131A1
WO2004023131A1 PCT/EP2003/009771 EP0309771W WO2004023131A1 WO 2004023131 A1 WO2004023131 A1 WO 2004023131A1 EP 0309771 W EP0309771 W EP 0309771W WO 2004023131 A1 WO2004023131 A1 WO 2004023131A1
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gradient
gradients
immobilized
ief
power supply
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PCT/EP2003/009771
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Michael Cahill
Pranav Sinha
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Proteosys Ag
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    • G01N27/26Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
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    • G01N27/44704Details; Accessories
    • G01N27/44747Composition of gel or of carrier mixture

Definitions

  • the invention relates to a method for producing “long”, i.e.> 30 cm long, immobilized pH gradients, in particular for isoelectric focusing, and a device for isoelectric focusing consisting of an IEF chamber (isoelectric focusing chamber) and a power supplier.
  • Zone electrophoresis b) Isotachophoresis c) Isoelectric focusing
  • Zone electrophoresis involves glycine, bicine and tricine buffered sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) for proteins, which is routinely used for the study of proteins (Wilkins et al. 1998).
  • Isotachophoresis uses hydrophilic matrix materials and typically shows high resolution but low loading capacity. In combination with free-flow electrophoresis, this method can be used for micro-preparative purposes (Weber and Bocek, 1998).
  • Isoelectric focusing is carried out either in liquid density gradients, in gel gradients (Righetti, 1990) or in multi-chamber devices with immobiline-based separating gel media (Righetti et al., 1997).
  • a pH gradient is formed by the formation of a concentration gradient of gel solutions with different pH values.
  • the acrylamido buffer monomers polymerize together with the arylamide matrix and are thus immobilized (Görg et al., 2000; Görg et al. 1988; Righetti, 1990).
  • These immobilized pH gradients (IPG) gels are poured by building up a density gradient with glycerol between the two solutions of different pH values. Since this process is diffusion-limited, the immobilizing gradients produced are typically less than 30 cm long in order to ensure a correct density gradient. Therefore, immobilized pH gradients longer than 30 cm have not been reported.
  • the longest commercially available IPGs are 24 cm long and are offered by Amersham Biosciences.
  • the aim of the invention is therefore to provide a method for producing immobilized pH gradients and a device for isoelectric focusing, which at least partially solves the disadvantages existing in the prior art.
  • This aim is achieved by the device and the methods as defined in claims 1, 9 and 17.
  • Preferred embodiments are set out in dependent claims 2 to 8, 10 to 16 and 18 to 28. The wording of all claims is hereby incorporated by reference into the content of the description.
  • the invention thus relates to a device for isoelectric focusing (IEF) with a so-called IEF chamber (chamber in which isoelectric focusing is carried out) and a power supply for providing a focusing voltage for at least one immobilized pH gradient, the device being a power supply has a maximum focusing voltage of at least 10 kV, preferably at least 20 kV, in particular at least 35 kV.
  • IEF isoelectric focusing
  • the power supply is arranged entirely in the IEF chamber.
  • This can be a power supply that supplies the voltages described above.
  • the present invention also includes those electricity suppliers that supply less than 10 kV or more than 35 kV.
  • the device has at least one pH gradient with a minimum length of 30 cm.
  • this pH gradient can preferably have a length of min. at least 40 cm, preferably at least 50 cm, in particular at least 90 cm.
  • the IEF chamber can be operated alone or in combination with the power supplier, one or more cables, at least one immobilized pH gradient and / or other components for isoelectric focusing.
  • the IEF chamber for immobilized pH gradients> 30 cm alone, as well as all conceivable combinations of this chamber with one or more further components for isoelectric focusing are hereby disclosed and made the subject of the present invention.
  • the power cables between the power supply and the IEF chamber can preferably be permanently installed, ie not removable, during the IEF.
  • the IPGs can also be surrounded by an electrically insulating material that can be solid or liquid.
  • the power supply can be coupled to the IEF chamber via at least one high-voltage-resistant cable which has a dielectric strength that is adapted to the maximum focusing voltage.
  • the power cables can be permanently installed between the power supply and the IEF chamber.
  • the electricity supplier is fully integrated in the IEF apparatus and is provided with a mechanism which switches the electricity supplier off as soon as the chamber is opened and thus ensures that no user of the apparatus is endangered by the current applied to the apparatus.
  • the apparatus can preferably have a locking means which prevents the IEF chamber from opening for a limited time, generally at least 2 minutes, after the power supply has been switched off, until has reduced any remaining high voltage to a safe level.
  • the device according to the invention is to be operated under high voltage, it is advantageous if cables are used which are suitable for the high voltage to be applied (in particular 10,000 to 30,000 volts), in particular voltage isolating, so that no dangerous voltage flashovers occur during operation.
  • the electrically conductive part of the cable can be completely isolated from the ambient air.
  • the invention further relates to a method for producing immobilized pH gradients, in particular for isoelectric focusing, the pH gradients being at least 30 cm in length.
  • the pH gradients have at least a length of 40 cm, preferably at least 50 cm, in particular at least 90 cm. Again, it should be remembered that no immobilized pH gradients longer than 30 cm have been reported. The longest commercially available IPGs are 24 cm long. Thus, the present invention does not “only” include the method for producing immobilized pH gradients with minimum lengths> 30 cm, rather the immobilized pH gradients themselves are also disclosed by the present invention and are hereby made the subject of it.
  • the density difference to build up a density gradient is at least 0.1 g / cm 3 , preferably 0.2 g / cm 3 , in particular greater than 0.2 g / cm 3 .
  • At least two buffer solutions are preferably used to generate these densities.
  • the following components or mixtures of the components are particularly suitable, for example: glycerol, cesium chloride, cesium sulfate, cesium bromide, sodium bromide, potassium bromide, sucrose.
  • polymerization initiators are continuously added to produce the pH gradients with the desired minimum lengths during the casting process via gels to be polymerized. This is preferably done by adding the polymerization initiators by means of computer-controlled applicators, in particular burettes or similar pumps.
  • solutions to be applied are preferably to be applied via gels that are still to be polymerized to understand in particular solutions containing acrylamido buffer) and the gels themselves cooled so that the pH gradients achieve the desired minimum length.
  • the temperature for starting the polymerization reaction can be increased in a controlled manner and / or polymerization initiators which can be activated after the gradient has been mixed can be used, so that the pH gradients have the desired minimum length as a result of these measures.
  • the present invention can also be used to perform isoelectric focusing (IEF) of analytes, such as. B. proteins, in at least one immobilized pH gradient, which was produced by one or more of the methods described above. It is therefore an extremely long immobilized pH gradient, the copolymerization of a preformed pH gradient into a matrix such. B. polyacrylamide or a polymer matrix with similar polymerization chemistry of monomers, similar to acrylamide and bisacrylamide.
  • the IEF is carried out under high voltages, at least 10,000 V, preferably at least 20,000 V, in particular at least 30,000 V.
  • a suitable substance is the dimethylpolysiloxane oil AK10 from Wacker-Chemie GmbH, 84489 Burghausen, Germany, which has insulation properties of better than 10 14 ohm cm.
  • the resolution capacity of the current state-of-the-art IPG strips and the resulting 2D-PAGE gels limit the number of proteins that can be detected. Because of this low resolution, only a similar number of proteins can be detected with less sensitive detection methods (e.g. silver staining or fluorescence staining) or with highly sensitive detection methods (e.g. radio imaging). However, if the resolution capacity of the 2D-PAGE gels is increased, a significant increase in the detection rate is achieved when using highly sensitive radio-imaging-based, fluorescence-based or mass-spectroscopy-based detection methods compared to other methods.
  • the analytes to be examined eg proteins
  • the analytes to be examined are marked, separated by 2D-PAGE and detected with a suitable detector.
  • two or more samples with different radio-isotopes or different mixtures of radio-isotopes, or different stable isotopes or fluorescent dyes or mass-different reagents are marked and separated together in a 2D-PAGE gel and then separately with suitable detectors detected.
  • a detector is required that can differentiate between the differently labeled samples on the basis of physical properties and half-lives of the labeling reagents used.
  • the immobilized pH gradients can be cut into so-called IPG strips (immobilized pH gradient strips) of any width after casting. These can then be stored until use, preferably at -20 ° C, or used directly for isoelectric focusing.
  • the sample to be analyzed, in particular proteins is then preferably introduced, ie loaded, into the IPG strips by means of active rehydration. In this process, the proteins become active during the rehydration of the dry IPG strips in a rehydration chamber, at low voltages, typically less than 1250 V.
  • the IPG strip is then often transferred to a second chamber that contains wide electrodes. The contact to the electrodes is made via conductive elements (media) (e.g.
  • the pictures show:
  • Fig. 1 2D gel of 150 g protein extract from human prostate cancer tissue focused on a 54 cm long IPG strip pH 4-8.
  • Human prostate cancer tissue was extracted and prepared for the IEF according to Vuong et al. (2000) with the modification that the proteins were not iodinated.
  • the gels were cast in a casting chamber (12 cm x 54 cm x 0.5 mm) consisting of two glass plates and a U-shaped spacer and a carrier film (Gel-Fix film, Serva, Heidelberg). For this purpose, the glass plates and spacers are carefully cleaned. The glass plate with spacer is then treated several times with Repel silanes (Amersham Biosciences, Freiburg). The gel fix film is placed on the cleaned and water-covered cover glass plate, covered with paper and the water removed with a rubber roller without air bubbles. Subsequently the plate is placed with the spacer and the chamber is provided with clamps. The gel chamber is then cooled to 4 ° C.
  • the acidic and basic solution consisting of acrylamido buffers, acrylamide, PDA (piperazine diacrylamide), KBr and TEMED (N, N, N ', N'-tetramethylethylenediamine) are prepared according to the chamber volume.
  • APS ammonium persulfate
  • the pouring of the gels and the computer-aided calculation of the mixing ratios of the acrylamido buffers (immobiline) to produce the pH gradient are carried out using the Altland and Altland (1984) method. The following immobilin ratios in a final volume of 10 ml were used to produce a linear pH 4-8 gradient.
  • the gradient is poured with computer-controlled burettes (Desaga), burette 1 containing the acidic solution, burette 2 the basic solution and burette 3 containing 2.5% (w / v) (weight / volume) ammonium persulfate solution.
  • the gels are left to stand for 10 minutes and then polymerized at 50 ° C. for 1 hour.
  • the gel is then washed with the carrier film 4 times in 15 minutes in 1.5% glycerol and dried.
  • the gel surface is covered with a film and the basic and acidic end is marked.
  • the gel is then cut into 4 mm strips and stored at -20 ° C until use. Isoelectric focusing
  • rehydration buffer 8M urea, 2% chaps, 0.5% (v / v) IPG buffer, 20 mM DTT (dithiothreitol), some bromophenol blue
  • the rehydration was carried out over 15 h at 100 V in a special rehydration chamber under DryStrip Cover Fluid (Amersham Biosciences, Freiburg). The strips were then transferred to a second chamber.
  • the contact between the ends of the IPG strips and the electrodes was made using 8M urea, 2% chaps (3 - ((3-cholamidopropyl) dimethylammonium) -1-propane sulfonate) soaked filter paper strips (8M urea, 2% chaps) ,
  • Electrophoresis gel media the State of the art. J. Chromatog. B 699, 63-75.
  • Electrophoresis 19, 3094-5.

Abstract

Die Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Herstellung von langen IPGs, d.h. IPGs mit einer Mindestlänge von 30 cm. Weiterhin wird die Anwendung von mehr als 10.000 Volt über eine Distanz von mehr als 30 cm für die isoelektrische Fokussierung beschrieben. Schließlich wird eine Vorrichtung für die isoelektrische Fokussierung bestehend aus einer sogenannten IEF-Kammer (isoelektrische Fokussierungskammer) und einem Stromversorger offenbart, wobei der Stromversorger Spannungen ≥ 10 kV liefert.

Description

Isoelektrische Fokussierung auf immobilisierten pH-Gradienten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von „langen", d.h. > 30 cm Länge, immobilisierten pH-Gradienten, insbesondere zur isoelektrischen Fokussierung, sowie eine Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung bestehend aus einer lEF-Kammer (isoelektrische Fokus- sierungskammer) und einem Stromversorger.
Die Verwendung von elektrophoretischen Methoden für präparative Zwecke ist eine etablierte Technik, und es existieren verschiedene Apparate für präparative und analytische Zwecke. Diese Apparate und ihre zugrunde liegenden Prinzipien können in drei Kategorien aufgeteilt werden (Andrews, 1986, Westermeier, 1977).
a) Zonenelektrophorese b) Isotachophorese c) Isoelektrische Fokussierung
Zonenelektrophorese beinhaltet die Glycin, Bicin und Tricin gepufferten Natriumdodecylsulfat -Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) für Proteine, die routinemäßig für die Untersuchung von Proteinen eingesetzt wird (Wilkins et al. 1998).
Die Isotachophorese benutzt hydrophile Matrixmaterialien und zeigt typischerweise eine hohe Auflösung, aber eine geringe Beladungskapazität. In Kombination mit Free-Flow-Elektrophorese kann diese Methode für mikropräparative Zwecke eingesetzt werden (Weber und Bocek, 1998).
Die isoelektrische Fokussierung (IEF) wird entweder in flüssigen Dichtegradienten, in Gelgradienten (Righetti, 1990) oder in Mehrkammer-Geräten mit Immobiline-basierenden Trenngelmedien (Righetti et al., 1997) durchgeführt.
Es gibt zwei etablierte lEF-Methoden im Rahmen der Durchführung einer zweidimensionalen Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE). Die als erstes entwickelte Methode verwendet eine Vorfokussierung von Trägerampholyten (TA) an ihren isoelektrischen Punkt und eine anschließende Fokussierung von Proteinen. Die so aufgetrennten Proteine werden dann in einer zweiten Dimension in einer SDS-PAGE aufgetrennt (Klose, 1975; Klose und Kobalz, 1995; O'Farrel, 1975). Dieses System besitzt eine hervorragende Auflösung und erreicht bei der Verwendung von 46 cm TA-IEF-Gelen eine Auftrennung von über 10.000 Proteinspots pro 2D-PAGE Gel (Klose und Kobalz, 1995). Kürzlich wurden auch kommerzielle Systeme mit bis zu 60 cm TA-IEF-Gelen angeboten (www.proteomefactory.com/ct_02112.html; Stand: 28.08.2002). Dennoch besteht bei diesem System das Problem, dass die basische Region des pH-Gradienten aus dem Gel heraus wandert, bevor ein Gleichgewicht erreicht ist. Diese kathodische Instabilität wird durch Bi- carbonat-lonen verursacht, welche mit atmosphärischem Kohlendioxid im Gleichgewicht stehen (Righetti, 1990). Um Proteine im basischen pH- Bereich zu untersuchen, wird ein lEF-Experiment vor dem Erreichen des Gleichgewichts abgestoppt. Zu diesem Zeitpunkt ist die Auftrennung der Proteine noch nicht komplett, aber die basische Region befindet sich noch im Gel. Diese Form der IEF (non-equilibrium pH gradient gel e- lectrophoresis, NEPHGE) ist die einzige Möglichkeit, basische Proteine in einem trägerampholyt-basierenden Gelsystem zu analysieren. Ein später entwickeltes System zur isoelektrischen Fokussierung verwendet acrylamid-ähnliche Acrylamido-Puffer Monomere (Immobiline), die eine funktionelle Puffergruppe tragen. Ein pH-Gradient wird durch die Bildung eines Konzentrationsgradienten von Gellösungen mit verschiedenen pH-Werten geformt. Nach der Bildung des Gradienten poly- merisieren die Acrylamido-Puffer-Monomere zusammen mit der Arcyla- mid-Matrix und werden somit immobilisiert (Görg et al., 2000; Görg et al. 1988; Righetti, 1990). Diese immobilisierten pH-Gradienten (IPG) - Gele werden gegossen, in dem man einen Dichtegradienten mit Glycerol zwischen den zwei Lösungen unterschiedlicher pH-Werte aufbaut. Da dieser Vorgang diffusionslimitiert ist, sind die hergestellten Immobilingra- dienten typischerweise weniger als 30 cm lang, um einen korrekten Dichtegradienten zu gewährleisten. Daher wurde bisher nicht über immobilisierte pH-Gradienten mit mehr als 30 cm Länge berichtet. Die längsten kommerziell erhältlichen IPGs sind 24 cm lang und werden von Amersham Biosciences angeboten.
Alle bisher entwickelten und erhältlichen Systeme zur isoelektrischen Fokussierung haben daher generell das Problem, dass sie kaum bzw. unvollständig basische Proteine auftrennen bzw. aufgrund der Limitation auf vergleichsweise kurze immobilisierte pH-Gradienten eine nicht ausreichende Auflösung aufweisen.
Erwünscht wäre daher ein System, in dem sämtliche Analyten, wie z.B. körpereigene Proteine, bei größtmöglicher Auflösung aufgetrennt und analysiert werden können.
Ziel der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten sowie eine Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung bereitzustellen, welches die im Stand der Technik vorhandenen Nachteile zumindest teilweise löst. Dieses Ziel wird erreicht durch die Vorrichtung und die Verfahren, wie sie in den Ansprüchen 1 , 9 und 17 definiert sind. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 8, 10 bis 16 und 18 bis 28 dargelegt. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass man besonders gute isoelektrische Fokussierungen durchführen kann, d.h. isoelektrische Fokussierungen mit extrem guter Auflösung und Auftrennung, wenn hierfür hohe Spannungen, also Spannungen > 10 kV, angelegt werden.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung (IEF) mit einer sogenannten lEF-Kammer (Kammer, in der die isoelektrische Fokussierung durchgeführt wird) und einer Stromversorgung zur Bereitstellung einer Fokussierungsspannung für mindestens einen immobilisierten pH-Gradienten, wobei die Vorrichtung eine Stromversorgung aufweist, die eine maximale Fokussierungsspannung von mindestens 10 kV, vorzugsweise mindestens 20 kV, insbesondere mindestens 35 kV, liefert. Dies ermöglicht die Verwendung langer pH- Gradienten, insbesondere mit Längen von mehr als 30 cm, wodurch sich die erzielbare Auflösung stark verbessert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Stromversorgung vollständig in der lEF-Kammer angeordnet. Dabei kann es sich um eine Stromversorgung handeln, der die weiter oben beschriebenen Spannungen liefert. Jedoch sind von der vorliegenden Erfindung auch jene Stromversorger umfasst, die weniger als 10 kV oder mehr als 35 kV liefern.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist die Vorrichtung mindestens einen pH-Gradienten mit einer Mindestlänge von 30 cm auf. Weiterhin kann vorzugsweise dieser pH-Gradient eine Länge von min- destens 40 cm, vorzugsweise mindestens 50 cm, insbesondere mindestens 90 cm, aufweisen. Es sei in diesem Zusammenhang daran erinnert, dass die Bereitstellung einer lEF-Kammer für IPGs > 30 cm schon für sich alleine eine erfinderische Leistung darstellt, da diese zuvor weder vorhanden noch beschrieben war. Somit kann die lEF-Kammer alleine oder in Kombination mit dem Stromversorger, einem oder mehrerer Kabel, mindestens einen immobilisierten pH-Gradienten und/oder weiterer Komponenten zur isoelektrischen Fokussierung betrieben werden. Die lEF-Kammer für immobilisierte pH-Gradienten > 30 cm alleine sowie alle denkbaren Kombinationen dieser Kammer mit einer oder mehreren weiteren Komponente(n) für die isoelektrische Fokussierung (z.B. Stromversorger, Kabel, immobilisierte pH-Gradienten, Verriegelungsmittel etc.) werden hiermit offenbart und zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemacht.
Die Stromkabel zwischen der Stromversorgung und der lEF-Kammer können vorzugsweise während der IEF fest installiert, also nicht entfernbar, sein. Die IPGs können weiterhin von einem elektrisch isolierenden Material umgeben sein, das fest oder flüssig sein kann.
Weiterhin kann die Stromversorgung mit der lEF-Kammer über mindestens ein hochspannungsfestes Kabel gekoppelt sein, das eine der maximalen Fokussierungsspannung angepasste Spannungsfestigkeit aufweist. Die Stromkabel können dabei zwischen der Stromversorgung und der lEF-Kammer fest installiert sein. In einer Variante ist der Stromversorger vollständig in der lEF-Apparatur integriert und mit einem Mechanismus versehen, der den Stromversorger abschaltet, sobald die Kammer geöffnet wird und somit sicherstellt, dass kein Benutzer der Apparatur durch den an die Apparatur angelegten Strom gefährdet wird. Vorzugsweise kann die Apparatur ein Verriegelungsmittel aufweisen, das ein Öffnen der lEF-Kammer nach Abschalten der Stromversorgung für eine begrenzte Zeit, in der Regel mindestens 2 min., verhindert, bis sich eine verbleibende Hochspannung auf einen ungefährlichen Wert abgebaut hat.
Wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung unter Hochspannung betrieben werden soll ist es vorteilhaft, wenn Kabel verwendet werden, die für die anzulegende Hochspannung ( insbesondere 10.000 bis 30.000 Volt) geeignet, insbesondere spannungsisolierend sind, so dass bei der Bedienung keine gefährlichen Spannungsüberschläge auftreten. Dabei kann der stromleitende Teil der Kabel vollständig von der Umgebungsluft isoliert sein.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten, insbesondere zur isoelektrischen Fokussierung, wobei die pH-Gradienten mindestens eine Länge von 30 cm aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die pH- Gradienten mindestens eine Länge von 40 cm, vorzugsweise mindestens 50 cm, insbesondere mindestens 90 cm, auf. Erneut sei daran erinnert, dass bisher nicht über immobilisierte pH-Gradienten mit mehr als 30 cm Länge berichtet wurde. Die längsten kommerziell erhältlichen IPGs sind 24 cm lang. Somit umfasst die vorliegende Erfindung nicht „nur" das Verfahren zur Herstellung immobilisierter pH-Gradienten mit Mindestlängen > 30 cm, vielmehr sind auch die immobilisierten pH- Gradienten selbst durch die vorliegende Erfindung offenbart und werden hiermit zu deren Gegenstand gemacht.
Mit 'der vorliegenden Erfindung können lange bis extrem lange IPGs hergestellt werden. Dabei ist eine charakteristische Eigenschaft dieser IPGs, dass diese immobilisierten pH-Gradienten über 30 cm lang sind, vorzugsweise bis ca. 100 cm oder mehr. Die Herstellung solch langer Gradienten ist schwierig. So ist, um einen gleichmäßig langen Gradienten zu erstellen, eine langsame, pulsationsfreie Flussrate der einzelnen, mindestens zwei, Pufferkomponenten beim Gießvorgang zu gewährleis- ten. Dieser Vorgang kann mit Hilfe von z. B. computergesteuerten "Kol- benbüretten" oder ähnlichen Pumpen ermöglicht werden. Um die langsamen Flussraten zu gewährleisten, ist eine Kontrolle der Polymerisationsgeschwindigkeit unerlässlich. Diese wird z.B. gewährleistet durch die kontinuierliche computergesteuerte Zugabe von Polymerisationsinitiatoren (wie z. B. Ammoniumperoxosulfat) während des Gießvorgangs oder durch eine Kühlung der Pufferlösungen und des gegossenen Gradienten und eine anschließende kontrollierte Temperaturerhöhung zum Starten der Polymerisation oder durch die Verwendung von nach der Mischung des Gradienten aktivierbaren Polymerisationsinitiatoren (z. B. UV-Licht induzierbar wie z. B. Riboflavin oder Methylenblau, Rabilloud et al., 1996b und darin enthaltene Referenzen) oder durch eine Kombination der vorher genannten Methoden. Für die Generation eines Dichtegradienten zur Herstellung von langen Gelen eignen sich bevorzugt schwere Pufferlösungen mit einer Dichte größer als 1 ,1. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt die Dichtedifferenz zum Aufbau eines Dichtegradienten mindestens 0,1 g/cm3, vorzugsweise 0,2 g/cm3, insbesondere größer als 0,2 g/cm3. Zur Generation dieser Dichten werden vorzugsweise mindestens zwei Pufferlösungen verwendet. Besonders geeignet sind beispielsweise folgende Komponenten oder Gemische der Komponenten: Glycerin, Cäsiumchlorid, Cäsiumsulfat, Cäsi- umbromid, Natriumbromid, Kaliumbromid, Saccharose.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zur Herstellung der pH- Gradienten mit den gewünschten Mindestlängen während des Gießvorgangs über noch auszupolymerisierende Gele kontinuierlich Polymerisationsinitiatoren zugegeben. Dies erfolgt vorzugsweise durch die Zugabe der Polymerisationsinitiatoren mittels computergesteuerter Applikatoren, insbesondere Büretten oder ähnliche Pumpen.
Vorzugsweise werden während des Gießvorgangs über noch auszupolymerisierende Gele zu applizierende Lösungen (unter Lösungen sind insbesondere Acrylamidopuffer enthaltende Lösungen zu verstehen) und die Gele selbst gekühlt, so dass die pH-Gradienten die gewünschte Mindestlänge erlangen. Nach der Kühlung der Lösungen und der Gele kann erfindungsgemäß weiterhin die Temperatur zum Starten der Polymerisationsreaktion kontrolliert erhöht werden und/oder nach Mischung des Gradienten aktivierbare Polymerisationsinitiatoren verwendet werden, so dass durch diese Maßnahmen die pH-Gradienten die erwünschte Mindestlänge aufweisen.
Die vorliegende Erfindung kann weiterhin dazu benutzt werden, isoelektrischen Fokussierungen (IEF) von Analyten, wie z. B. Proteinen, in mindestens einem immobilisierten pH-Gradienten vorzunehmen, der durch eines oder mehrerer der weiter oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde. Es handelt sich damit um einen extrem langen immobilisierten pH-Gradienten, wobei die Copolymerisation eines vorgeformten pH-Gradienten in eine Matrix wie z. B. Polyacrylamid oder einer Polymermatrix mit ähnlicher Polymerisationschemie von Monomeren, ähnlich zu Acrylamid und Bisacrylamid, erfolgt. In einer bevorzugten Variante der Erfindung wird die IEF unter hohen Voltzahlen, mindestens 10.000 V, vorzugsweise mindestens 20.000 V, insbesondere mindestens 30.000 V, durchgeführt. Derart hohe Voltzahlen wurden bisher von Experten vermieden, weil man befürchtete, dass die Entstehung von Entladungsfunken und die Hitzeentwicklung den isoelektrischen Fokus- siervorgang stören könnte und wegen der potentiellen Gefahr für Mitarbeiter. Hieraus folgte aber, dass die Fokussierzeit für z. B. 54 cm IPG- Stre*ifen pH 4-8 bei 10.000 V 75 Stunden dauert; in Gegensatz zu weniger als 37 Stunden bei einer Voltzahl von 20.000 V, und 25 Stunden bei einer Voltzahl von 30.000 V. Daher stellt die Anwendung von hohen Voltzahlen während der IEF von langen IPGs eine erfinderische Leistung dar, die den Durchsatz stark erhöht und darüber hinaus die Spotgröße der an ihrem isoelektrischen Punkt (pl) fokussierten Proteine verkleinert. Die hohen Voltzahlen werden durch die Verwendung eines e- lektrisch isolierenden Mediums, insbesondere eines Öls, ermöglicht, das die Elektroden und die IPG-Streifen während der IEF umgibt.
Eine geeignete Substanz ist das Dimethylpolysiloxanöl AK10 der Firma Wacker-Chemie GmbH, 84489 Burghausen, Deutschland, das Isolationseigenschaften von besser als 1014 Ohm cm aufweist.
Es hat sich in der Praxis als vorteilhaft herausgestellt, wenn die immobilisierten pH-Gradienten unter einer Ölschicht oder einer ähnlichen organischen/elektrisch isolierenden Schicht fokussiert werden, da die immobilisierten pH-Gradientengele ansonsten über die Zeit langsam durch Wasserverlust an die Atmosphäre austrocknen würden.
Die Auflösungskapazität von dem derzeitigen Stand der Technik entsprechenden IPG-Streifen und die resultierenden 2D-PAGE Gele limitieren die Anzahl der Proteine, die detektiert werden können. Aufgrund dieser geringen Auflösung können mit wenig sensitiven Detektions- methoden (z. B. Silberfärbung oder Fluoreszenzfärbung) oder mit hochsensitiven Detektionsmethoden (z .B. Radio-Imaging) nur eine ähnliche Anzahl an Proteinen detektiert werden. Wenn jedoch die Auflösungskapazität der 2D-PAGE Gele erhöht wird, erzielt man bei der Verwendung von hochsensitiven Radio-Imaging basierenden, fluoreszenz-basieren- den oder massenspektroskopie-basierenden Detektionsverfahren im Vergleich zu anderen Methoden eine signifikante Steigerung der Detek- tionsrate. In diesem Zusammenhang ist es vorteilhaft, wenn mindestens zwe'i verschiedene Proben mit unterschiedlichen Radioisotopen und/ oder verschiedenen Gemischen von Radioisotopen und/oder mindestens zwei Proben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen und/ o- der verschiedener Gemische von Fluoreszenzfarbstoffen und/oder mindestens zwei verschiedene Proben mit unterschiedlichen stabilen Isotopen und/oder verschiedenen Gemischen von stabilen Isotopen und/ o- der mindestens zwei verschiedene Proben mit unterschiedlichen mas- sendifferenten Reagenzien markiert werden.
In diesen bevorzugten Darstellungen der Erfindung sind die zu untersuchenden Analyten (z. B. Proteine), insbesondere mit Radioisotopen, stabilen Isotopen, Fluoreszenzfarbstoffen oder massendifferenten Reagenzien, markiert, durch 2D-PAGE aufgetrennt und mit einem geeigneten Detektor detektiert. In dieser besonders bevorzugten Variante der Erfindung werden zwei oder mehr Proben mit unterschiedlichen Radio-Isotopen oder verschiedenen Gemischen von Radio-Isotopen, oder verschiedenen stabilen Isotopen oder Fluoreszenzfarbstoffen oder massendifferenten Reagenzien markiert und in einem 2D-PAGE Gel zusammen aufgetrennt und anschließend separat mit geeigneten Detektoren detektiert. Dieses ermöglicht die Erstellung von Gelbildern, der einzelnen ursprünglichen markierten Proben. Für diese besondere Art der Analyse wird ein Detektor benötigt, der auf der Basis von physikalischen Eigenschaften und Halbwertszeiten der verwendeten Markierungsreagenzien zwischen den unterschiedlich markierten Proben unterscheiden kann.
Die immobilisierten pH-Gradienten können erfindungsgemäß nach dem Gießen in sogenannte IPG-Streifen (immobilisierte pH-Gradienten- Streifen) beliebiger Breite geschnitten werden. Diese können dann bis zur Verwendung gelagert, vorzugsweise bei -20°C, oder direkt für die isoelektrische Fokussierung verwendet werden. Die zu analysierende Probe, insbesondere Proteine, werden dann vorzugsweise mittels aktiver' Rehydratation in die IPG-Streifen eingebracht, d.h. beladen. In diesem Prozess werden die Proteine aktiv, während der Rehydratation der trockenen IPG-Streifen in einer Rehydratationskammer, bei geringer Voltzahl, typischerweise weniger als 1250 V, eingebracht. Der IPG- Streifen wird dann häufig in eine zweite Kammer transferiert, die weite Elektroden enthält. Der Kontakt zu den Elektroden wird über leitende Elemente (Medien) (z. B. Wasser enthaltende und/oder mit wässrigen, Chemikalien enthaltende Lösungen getränkte Filterpapierstreifen) an beiden Enden der IPG-Streifen hergestellt. Die Filterpapierstreifen werden in zeitlichen Intervallen während der IEF mindestens einmal ausgetauscht, um im Filterpapier akkumulierende Ionen zu entfernen. Die Entfernung dieser im Filterpapier akkumulierenden Ionen ist für hochwertige Resultate besonders vorteilhaft.
Schließlich ist von Vorteil, wenn die Temperatur während der isoelektrischen Fokussierung nahezu konstant gehalten wird, um die Reproduzierbarkeit der IEF zu verbessern. Maximale Temperaturschwankungen von +/- 5 °C, insbesondere von +/- 2 °C, sind hierbei bevorzugt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die isoelektrische Fokussierung in langen bis extrem langen immobilisierten pH-Gradienten (> 30 cm Länge) insbesondere durch eine Kombination der nachfolgend beschriebenen verschiedenen Faktoren ermöglicht wurde:
a. Die Verwendung computergesteuerter Applikatoren, insbesondere Büretten, zur reproduzierbaren Herstellung der pH-Gradienten. b. Die Verwendung einer elektrisch isolierenden Schicht, insbesondere einer Ölschicht, während der Fokussierung, so dass die Austrocknung der Gele an der Atmosphäre verhindert werden kann. c. Die Verwendung von sehr hohen Spannungen während der Fo- kussierungsprozedur.
Diese Methoden stellen eine wertvolle Erweiterung der bisher bestehenden Möglichkeiten zur Untersuchung komplexer Zusammenhänge, wie sie z.B. in der Proteomforschung vorliegen, dar, so dass Wissenschafter bzw. Forschungsunternehmen sowie alle auf diesem oder anderer Gebiete tätigen mit Hilfe der vorliegenden Erfindung in die Lage versetzt werden, Zusammenhänge aufzuklären und neue Erkenntnisse zu gewinnen. Die bestehenden Merkmale und weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen und der Figur. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Abbildungen zeigen:
Fig. 1 : 2D-Gel von 150 g Proteinextrakt aus menschlichem Prostatakrebsgewebe fokussiert auf einem 54 cm langen IPG- Streifen pH 4-8.
Das nachfolgende Beispiel dient zur näheren Erläuterung der Erfindung.
Material und Methoden:
Menschliches Prostatakrebsgewebe wurde extrahiert und für die IEF vorbereitet nach Vuong et al. (2000) mit der Modifikation, dass die Proteine nicht jodiert wurden.
Herstellung von 54 cm langen IPG-Gelen
Die Gele wurden in einer Gießkammer (12 cm x 54 cm x 0,5 mm) bestehend aus zwei Glasplatten und einem U-förmigen Abstandhalter und einer Trägerfolie (Gel-Fix Folie, Serva, Heidelberg) gegossen. Die Glasplatten und Spacer werden hierzu sorgfältig gereinigt. Die Glasplatte mit Spacer wird anschließend mehrfach mit Repel-Silane (Amersham Bio- sciences, Freiburg) behandelt. Die Gel-Fixfolie wird auf die gereinigte und mit Wasser bedeckte Deckglasplatte gelegt, mit Papier bedeckt und mit einer Gummiwalze das Wasser luftblasenfrei entfernt. Anschließend wird die Platte mit dem Abstandhalter aufgesetzt und die Kammer mit Klemmen versehen. Die Gelkammer wird dann auf 4 °C gekühlt. Zur Vorbereitung der Gellösungen werden gemäß Kammervolumen die saure und basische Lösung bestehend aus Acrylamido-puffern, Acrylamid, PDA (Piperazin-diacrylamid), KBr und TEMED (N,N,N',N'-Tetramethyl- ethylendiamin) vorbereitet. APS (Ammoniumpersulfat) wird später während der Gradientenherstellung kontrolliert zugesetzt. Das Gießen der Gele und die computergestützte Berechnung der Mischungsverhältnisse der Acrylamidopuffer (Immobiline) zur Herstellung des pH-Gradienten erfolgt nach der Methode von Altland und Altland (1984). Für die Herstellung eines linearen pH 4-8 Gradienten wurden folgende Immobilin- Verhältnisse in einem Endvolumen von 10 ml verwendet.
Saure Lösung Basische Lösung
Immobiline pK 3,6 392,5 l 0,0 l
Immobiline pK 4,6 169 l 369,2 μ\
Immobiline pK 6,2 156,8 l 239,6 μ\
Immobiline pK 7,0 78,2 /l 94,7 μl
Immobiline pK 8,5 113,04 l 222,7 μl
Der Gradient wird mit computergesteuerten Büretten (Desaga) gegossen, wobei Bürette 1 die saure Lösung, Bürette 2 die basische Lösung und Bürette 3 die 2,5 % (w/v) (Gewicht/Volumen) Ammoniumpersulfatlösung enthält. Die Gele werden nach dem Gießen für 10 min stehen gelassen und dann 1 h bei 50 °C auspolymerisiert. Anschließend wird das Gel' mit der Trägerfolie 4 mal 15 Minuten in 1 ,5 % Glycerol gewaschen und getrocknet. Die Geloberfläche wird mit einer Folie abgedeckt und das basische und saure Ende markiert. Anschließend wird das Gel in 4 mm breite Streifen geschnitten und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. Isoelektrische Fokussierung
150 μg Protein in 1200 μl Rehydratisierungspuffer (8M Harnstoff, 2 % Chaps, 0,5 % (v/v) IPG Puffer, 20 mM DTT (Dithiothreitol), etwas Bromphenolblau) werden zur Rehydratation der IPG-Streifen verwendet. Die Rehydratation erfolgte über 15 h bei 100 V in einer speziellen Rehydratationskammer unter DryStrip Cover Fluid (Amersham Biosciences, Freiburg). Anschließend wurden die Streifen in eine zweite Kammer überführt. Hier wurde der Kontakt zwischen den Enden der IPG-Streifen und der Elektroden mittels 8M Harnstoff, 2 % Chaps (3-((3-Cholamidopro- pyl)dimethylammonium)-1 -propansulfonat) getränkten Filterpapierstreifen (8M Harnstoff, 2 % Chaps) hergestellt.
Zur Fokussierung der Proben wurde folgendes Programm verwendet:
500 V 1 Stunde
1250 V 1 Stunde
2500V 30 Minuten
20.000V bis 125.000 Voltstunden
Diese Filterpapierstreifen wurden dann nach den ersten drei Fokussie- rungsschritten gewechselt. Die Ströme wurden limitiert auf 60 Mikroampere je IPG-Streifen. Bei anderen Versuchen wurden Spannungen bis zu 35.000 Volt unter ähnlichen Bedingungen angewendet.
Nach der Fokussierung wurden die 54 cm Streifen in 3 x 18 cm Streifen zerschnitten und in der zweiten Dimension (2D-SDS-PAGE) aufgetrennt, wie bei Vuong et al. (2000) beschrieben. Die Färbung der Gele mittels Silber er olgte nach Heukeshoven und Dernick (1988). LITERATUR:
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Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung (IEF) mit einer sogenannten lEF-Kammer und einer Stromversorgung zur Bereitstellung einer Fokussierungsspannung für mindestens einen immobilisierten pH-Gradienten, dadurch gekennzeichnet, dass die Stromversorgung eine maximale Fokussierungsspannung von mindestens 10 kV, vorzugsweise mindestens 20 kV, insbesondere mindestens 35 kV, liefert.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Stromversorgung vollständig in der lEF-Kammer angeordnet ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen pH-Gradienten mit einer Mindestlänge von 30 cm aufweist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Gradient mindestens eine Länge von 40 cm, vorzugsweise mindestens 50 cm, insbesondere mindestens 90 cm, aufweist.
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stromversorgung mit der lEF-Kammer über mindestens ein hochspannungsfestes Kabel gekoppelt ist, das eine der maximalen Fokussierungsspannung angepasste Spannungsfestigkeit aufweist.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Stromkabel zwischen Stromversorgung und lEF-Kammer fest installiert sind.
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die lEF-Kammer eine Sicherungseinrichtung aufweist, die bei Öffnung der lEF-Kammer die Stromversorgung ausschaltet.
8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Verriegelungsmittel aufweist, das ein Öffnen der lEF-Kammer nach Abschalten der Stromversorgung verhindert, bis sich eine verbleibende Hochspannung auf einen ungefährlichen Wert abgebaut hat.
9. Verfahren zur Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten, insbesondere zur isoelektrischen Fokussierung, dadurch gekennzeichnet, dass die pH-Gradienten mindestens eine Länge von 30 cm aufweisen.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die pH-Gradienten mindestens eine Länge von 40 cm, vorzugsweise mindestens 50 cm, insbesondere mindestens 90 cm, aufweisen.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Dichtegradient mit einer Dichtedifferenz von mindestens 0,1 g/cm3, vorzugsweise mindestens 0,2 g/cm3, insbesondere größer 0,2 g/cm3, aufgebaut wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Dichtegradient durch Verwendung mindestens zweier Pufferlösungen aufgebaut wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Pufferlösungen um mindestens eine Komponente aus der Gruppe Glycerin, Cäsiumchlorid, Cäsiumsulfat, Cäsiumbro- mid, Natriumbromid, Kaliumbromid und/oder Saccharose handelt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass während des Gießvorgangs über noch auszupoly- merisierende Gele kontinuierlich Polymerisationsinitiatoren zugegeben werden.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zugabe der Polymerisationsinitiatoren mittels computergesteuerter Applikatoren, insbesondere Büretten, erfolgt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass während des Gießvorgangs über noch auszupoly- merisierende Gele zu applizierende Pufferlösungen und die Gele selbst gekühlt werden und anschließend die Temperatur zum Starten der Polymerisationsreaktion kontrolliert erhöht wird und/oder nach Mischung des Gradienten aktivierbare Polymerisationsinitiatoren verwendet werden.
17. Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung von Analyten, insbesondere Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass immobilisierte pH-Gradienten nach einem der Ansprüche 9 bis 16 hergestellt werden.
18. ' Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass eine
Hochspannung von mindestens 10.000 Volt, vorzugsweise mindestens 20.000 Volt, insbesondere mindestens 30.000 Volt, appli- ziert wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten pH-Gradienten unter eine Ölschicht oder eine ähnlich elektrisch isolierende Schicht fokus- siert werden.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyten mittels 2D-PAGE aufgetrennt und anschließend detektiert werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyten mit mindestens zwei unterschiedlichen Radioisotopen, Fluoreszenzfarbstoffen, stabilen Isotopen, massendifferenten Reagenzien und/oder deren Gemischen markiert werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten pH-Gradienten in sogenannte IPG-Streifen (immobilisierte pH-Gradienten-Streifen) geschnitten und die Analyten während einer Rehydratisierung in diese IPG- Streifen eingebracht werden.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Rehydratisierung bei einer Spannung < 1.250 Volt erfolgt.
24. Ver ahren nach einem der Ansprüche 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass nach Einbringung der Analyten und während der isoelektrischen Fokussierung die IPG-Streifen an beiden Enden über elektrisch leitende und Ionen aufnehmende Elemente mit entsprechenden Elektroden verbunden sind.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Elementen um Wasser enthaltende Filterpapierstreifen handelt.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterpapierstreifen mit einer wässrigen, Chemikalien enthaltenden Lösung, getränkt sind.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Elemente während der isoelektrischen Fokussierung mindestens einmal ausgetauscht werden.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur während der isoelektrischen Fokussierung nahezu konstant gehalten wird.
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